Контроль чистоты линий лабораторных животных с использованием микросателлитных ДНК

  • Марина Владимировна Пинюгина ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, Москва
  • Е. Н. Кособокова ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, Москва
  • В. С. Косоруков ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, Москва
  • Ю. М. Букреев ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, Москва

Аннотация

При проведении доклинических исследований безопасности и эффективности лекарственных средств наиболее востребованным видом лабораторных животных являются мыши Mus musculus. Для получения статистически достоверных и воспроизводимых результатов требуются не только четкое соблюдение условий содержания и проведения опыта, но и стандартизованная модель, что обеспечивается использованием инбредных линий животных. С другой стороны, близкородственное скрещивание влечет за собой возникновение спонтанных мутаций и перерождение линии. Подобные мутации не обязательно сопровождаются морфологическими или очевидными физиологическими изменениями. В таком случае единственным надежным способом контроля чистоты линии является генетический. В SPF-лабораториях чаще всего для этих целей используют ДНК-маркеры, основанные на вариабельности микросателлитных участков ДНК.Цель: разработка метода генетического мониторинга лабораторных мышей на основе ДНК-маркеров.Методы: в исследовании использовали лабораторных мышей линии BALB/cJLac и С57Bl/6y. Выделение геномной ДНК из ушной раковины животных проводили при помощи наборов Genomic DNA Purification Kit (Thermo scientific, Lithuania).В качестве ДНК-маркеров выбрали микросателлиты, как наиболее часто используемые маркеры для генотипирования лабораторных животных (крыс, мышей). Для проведения ПЦР подобрали линейку праймеров (микросателлитные ДНК): (GAG)6C, (CTC)6C, (CTC)6A, AG9-1, AG9-2.Результаты ПЦР оценивали посредством электрофореза в 1,5% агарозном геле. Для визуализации ДНК использовали краситель SYBR (Life technologies).Результат: сравнительный анализ использования разных праймеров из представленной линейки показал, что не все из них удобны для визуального анализа, в виду получения большого количества  амплификатов близкого размера, затрудняющих сравнение разных образцов. В таком случае прибегали к помощи программного обеспечения GeneTools (Syngene). Использованные маркеры позволяли достоверно различить 2 линии мышей, что было подтверждено при «слепой» идентификации отдельных особей. С целью контроля результатов был получен заведомо ложный вариант посредством скрещивания животных разных линий, который позволил оценить ревалентность каждого из праймеров. Данные свидетельствуют о том, что при перекрестном скрещивании каждая из линий вносит свой вклад в распределение аллелей в локусах. Это позволяет даже визуально оценить возможное «загрязнение» линии. По результатам работы была составлена таблица распределения аллелей в локусах, выявляемых при помощи ДНК-маркирования, для каждой из использованных линий.Выводы: разработанная методика позволяет определить или подтвердить принадлежность конкретного экземпляра к той или иной линии с сохранением животного и возможностью его дальнейшего использования в эксперименте. Таким образом, данная методика пригодна для мониторинга чистоты линии лабораторных животных.
Опубликован
2017-12-27
Раздел
Материалы конференций