Технология создания генетически модифицированных мышей: определение оптимального количества мышей в колонии

  • Елена Ивановна Леонова Институт Трансляционной биомедицины СПБГУ, Санкт Петербург
  • Ольга Александровна Аверина Испытательный центр «Виварно-экспериментальный комплекс ООО «НИИ Митоинженерии МГУ»», Москва
  • Рауль Радикович Гайнетдинов Институт Трансляционной биомедицины СПБГУ, Санкт Петербург

Аннотация

Одна из приоритетных задач в биомедицине – создание экспериментальных животных моделей для изучения заболеваний человека. Благодаря открытию новой технологии редактирования генома эукариотических организмов CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) – Сas9 (CRISPR-associated nuclease 9) появилась уникальная возможность нокаутировать ген у животного уже в первом поколении. [1] Для создания нокаутных мышей с высокой эффективностью, необходимо одновременно получить определенное количество оплодотворенных яйцеклеток экспериментальной линии от самок-доноров, и псевдобеременных реципиентов для трансплантации яйцеклеток после введения генетической конструкции.Целью данной работы является определение оптимального количества мышей в колонии для получения генетически модифицированной линии.Материалы и методы: для получения оплодотворенных яйцеклеток использовались самцы и самки мышей 3-х линий: C57Bl/6, NOD/SCID, и гибриды первого поколения (F1), полученные в результате скрещивания самок СBA и самцов C57Bl/6 (F1 C57Bl/6/CBA). Для гарантированного получения оплодотворенных клеток самки в возрасте 4-5 недель подвергались дополнительной гормональной стимуляции: внутрибрюшинные инъекции гонадотропина сыворотки жеребых кобыл и через сутки хориогонического гонадотропина человека, но не позднее, чем за 10 часов до ссаживания с самцами. Далее каждую самку подсаживали к самцу этой же линии [2]. Для получения эффекта псевдобеременности у реципиентов, самок CD1 и F1 ссаживали с вазэктомированными самцами CD1 и F1. На следующее утро после спаривания, самок доноров и реципиентов отбирали в эксперимент по наличию копулятивных пробок (подтверждение факта спаривания с самцом).Результаты: в результате исследования было выяснено, что при правильном питании, частота использования самца определяется его происхождением. Так, чтобы получить максимальное количество забеременевших самок, необходимо использовать самцов F1 C57Bl/6/CBA через 2-3 дня, C57Bl/6 - 1 раз в семь дней, а NOD/SCID – не реже, чем 1 раз в 15 дней, поэтому для последних более эффективно проводить оплодотворение in vitro [3].Заключение: Для создания генетически модифицированных мышей необходимо иметь как минимум 30 вазэктомированных самцов CD1 или F1 C57Bl/6/CBA, к каждому из которых подсаживать по 3 самки, для получения псевдобеременных. Для получения оплодотворенных яйцеклеток при условии подсадки не более 10 самок, количество самцов будет завесить от линии: F1 C57Bl/6/CBA - 20, C57Bl/6 – как минимум 30. NOD/SCID – 50, но, чтобы не содержать такую большую колонию для последних достаточно иметь 20 самцов и проводить оплодотворение in vitro.

Литература

1. Williams A., Henao-Mejia J., FlavellR.A., Cold Spring Harb. Protoc. (2016)
2. KumarT.R., LarsonM., WangH., McDermottJ., BronshteynI., Mol. Endocrinol., Humana Press, Totowa, NJ, (2009).
3. LiF., CowleyD.O., BannerD., HolleE., ZhangL., SuL., Sci. Rep. 4 (2014).
Опубликован
2017-10-20
Раздел
Материалы конференций